微型荧光显微镜是记录自由活动啮齿类动物大规模神经活动最强大、最多功能的工具之一，具有单细胞分辨率。基因编码钙指示剂设计的最新进展，使得能够以不重叠的发射光谱谱线来标记不同的神经元群体。然而，传统微型显微镜仅限于单一激发、单一焦平面成像，这无法补偿色差，也不能对两种光谱不同的钙指示剂进行成像。
本文介绍了一种开源双通道微型显微镜，能够同时对遗传学或功能上不同的神经元群体进行成像。色差通过使用电润湿透镜进行校正，该透镜可实现帧间焦平面的快速切换。为了展示双通道微型显微镜的性能，研究人员用红色荧光蛋白标记了内侧前额叶皮层中特定层的兴奋性神经元或抑制性中间神经元，并通过绿色基因编码钙指示剂同时记录了自由活动小鼠不同神经元群体的神经活动。
一、介绍
理解神经网络活动模式与行为之间的因果关系是神经科学中长期存在的一个基本问题。为了更深入地认识神经元群体如何调控不同的行为，利用荧光指示剂进行钙成像技术，提供了前所未有的视角，使我们能够在数周至数月的时间尺度上，观察成百上千个神经元的单细胞活动。近年来，荧光显微镜的小型化极大拓展了钙成像技术所能应用的行为范式范围，从学习与记忆到复杂行为，如社会交互、恐惧条件反射以及操作性行为。
展开剩余93%微型荧光显微镜领域的最新进展包括：使用双LED微型显微镜实现同步成像与光遗传学操控，以及在商业和学术系统中正在被提出的初步版本双色微型显微镜。
为双色成像或同步成像与光遗传操控提供多光源的一种方法，是通过光纤将外部光源与微型显微镜耦合。然而，这种方法无法解决使用梯度折射率透镜成像时的色差问题，并且可能限制动物的活动自由度。
本文提出一种双色微型显微镜版本，能够通过在交替帧中切换光源和焦平面来补偿色差。
二、材料与方法
01.微型显微镜
微型显微镜的设计包含一个带有可调谐透镜的双LED单光子荧光显微镜，采用Solidworks软件设计，并使用黑色树脂材料3D打印而成。该设计引入了两个独立的、光谱不同的光源，波长分别为470纳米和565纳米。微型显微镜的设计展示于图1A，完整组件清单列于表1。一块定制印刷电路板承载了CMOS图像传感器，该传感器与LED同步，并将数据流传输至一块定制的现场可编程门阵列控制板。
图1. （A）微型显微镜设计图（部件清单对应表1）。（B）左图：1951 USAF分辨率测试标板的图像。右图：分别对应左图中蓝色和红色高亮所示的列与行的像素强度值，展示了组7元素6，对应4.4毫米分辨率及约3.3倍放大率。（C）微型显微镜LED及滤光片的光谱图。（D）图表显示了交替通道配置下微型显微镜信号的时序，在此配置下生成两个交错的视频流。比例尺为100毫秒，反映了具有代表性的10帧/秒的图像传感器帧率。（E）在单通道记录和双色交替配置下，对45度景深标靶成像期间，不同测试记录所获得的焦平面深度图。焦平面深度是根据电润湿透镜控制信号，基于图F所示的拟合线性模型计算得出。（F）在单通道记录和双色交替配置下，对不同焦深下拍摄的45度景深标靶中15线对/毫米垂直线所对应的平均帧进行列平均后的结果。
表1. 材料清单。
所有实验程序均获得怀俄明大学及美国国家药物滥用研究所动物保护与使用委员会的批准，并依照美国国立卫生研究院的指导方针进行。实验使用的Gad2-IRES-Cre雄性和雌性繁殖鼠购自杰克逊实验室。Tardbp flox/flox 及 CaMKII-IRES-Cre; TardbpF/F 雄性和雌性繁殖鼠由约翰斯·霍普金斯大学医学院研究人员实验室提供。这些小鼠品系在怀俄明大学繁育和饲养。小鼠饲养于12小时光暗循环条件下，每笼最多五只，自由获取食物和水。
香港星云先进技术有限公司（NAT）是Grintech亚洲代理商，我们为客户提供梯度折射率透镜（GRIN透镜）等光学产品。
02.立体定位注射
根据已发表的方案，对9至11月龄的TardbpF/F雄性和雌性小鼠进行内侧前额叶皮层区域的双侧病毒注射。小鼠麻醉后固定于立体定位仪，通过加热垫维持体温在35°C。使用牙科钻在颅骨上钻孔，通过微量注射泵控制的微升注射器，以500纳升/分钟的流速，在指定坐标处双侧各注射500纳升病毒。左侧内侧前额叶皮层注射AAVretro-hSyn-mCherry，右侧注射经1:2稀释的AAV1-CaMKII-GCaMP6f。术后3天，小鼠饮用水中添加布洛芬，并恢复14天。
对12至13月龄的Gad2-IRES-Cre小鼠进行右侧内侧前额叶皮层的连续两次病毒注射标记。首次注射1:2稀释的AAV1-hSyn-GCaMP6f，以绿色荧光钙指示剂标记所有神经元。恢复14天后，在同一区域进行第二次病毒注射，使用AAV1-CAG-DIO-NLS-tdTomato，以tdTomato标记GABA能神经元。
对3至5月龄的CaMKII-IRES-Cre; TardbpF/F小鼠进行单侧注射，使用AAV1-CaMKII-GCaMP6f和AAV1-CAG-DIO-NLS-tdTomato的1:1混合病毒，使得GCaMP6f标记所有锥体神经元，而tdTomato标记所有表达Cre的细胞。tdTomato的表达需在他莫昔芬诱导Cre重组酶活性后才会发生。
03.梯度折射率透镜植入
按照已发表的实验室方案，在右侧内侧前额叶皮层区域植入梯度折射率透镜。小鼠使用氯胺酮/甲苯噻嗪混合麻醉，并在手术部位备皮。固定小鼠头部后，切除三角形皮肤区域，剩余皮肤用氰基丙烯酸酯粘附于颅骨。使用钻头在相对于前囟的指定坐标处钻孔。通过连接真空系统的27G钝头针，将脑组织逐层吸除至1.8毫米深度，同时持续灌注用95%氧气和5%二氧化碳平衡的人工脑脊液。清理创腔后，将直径1毫米的梯度折射率透镜植入，并用两层牙科水泥固定，最后盖上定制保护帽。术后3天饮水中添加布洛芬，恢复一个月。
04.底座安装
使用异氟烷麻醉小鼠并固定于立体定位仪。将装有底座的双色微型显微镜通过定制的电动控制器移动至透镜附近，使显微镜聚焦于透镜内的视野。通过两轮牙科水泥应用将底座固定。待水泥凝固后，移走显微镜主体，并用与底座匹配的保护帽覆盖透镜。
05.重复体内钙成像
在钙成像实验日，用异氟烷短暂麻醉小鼠。将双色微型显微镜固定于底座上，让小鼠从麻醉中恢复30分钟。记录期间，让小鼠在方形开阔场地中自由探索15分钟。使用定制的钙成像软件NeuView记录钙图像。通过最大化检测到的神经元数量确定最佳焦平面，并将LED功率设定在足够低以避免因峰值活动荧光导致图像传感器像素饱和。对于双色记录，LED1用于捕捉代表GCaMP6f波动的绿色通道，LED2用于捕捉静态的红色信号。小鼠在开阔区域的行为通过行为记录软件记录。每只小鼠的绿色通道记录以每秒10帧的帧率进行，每次记录时长3.5分钟。红色通道记录则在多个焦平面进行，通过改变可调透镜的脉冲宽度调制控制信号，每个平面采集约100帧。钙成像和行为记录以每周一次的间隔重复进行4至5个月。通过参考之前的钙成像记录，调整脉冲宽度调制控制信号及X和Y偏移，确保同一小鼠在多次记录中视野保持一致。
对于CaMKII-IRES-Cre; TardbpF/F小鼠，在他莫昔芬诱导前进行三次体内钙成像记录作为神经元基线。随后，用含有他莫昔芬的饲料喂养约18至21天以诱导Cre重组酶依赖的tdTomato表达。之后，每周对这些小鼠进行一次开阔场地测试中的重复体内钙成像记录。
06.神经数据分析
来自微型显微镜CMOS传感器的每一帧图像均通过3×3中值滤波器处理，并使用基于傅里叶变换的定制图像配准方法进行运动校正，以补偿显微镜运动引起的X-Y偏移。对于包含GCaMP6f动态信号的绿色通道，使用基于约束非负矩阵分解的方法CaImAn提取每次记录的神经元轮廓和活动轨迹。对于每次由3次记录构成的实验单元，对神经元进行配准，并通过平均每次检测到的神经元轮廓来创建单元神经元图谱。该图谱用于通过基于感兴趣区域的方法，估算在未被CaImAn检测到的记录中神经元的活动。
对于捕捉tdTomato表达神经元静态荧光的红色通道，对每个焦平面记录的平均图像进行高通滤波和分割，以识别tdTomato标记神经元的胞体。
在对每个实验单元的两个通道的平均图像进行配准后，基于其轮廓至少50%的重叠度来匹配单个神经元。
07.焦平面估算
为了评估电润湿透镜控制信号变化对使用45度景深靶标测得的焦平面深度的影响，我们计算了每个焦深下100帧记录的平均帧的列平均像素值，这反映了沿X轴检测到的15线对/毫米垂直线。所得曲线近似为截断至一次谐波的傅里叶级数，并乘以指数包络曲线，其中中心参数b表示估算的焦平面深度。
基于每个控制信号脉冲宽度调制对应的估算焦深，研究人员拟合了一个线性模型来近似描述控制信号占空比与最终焦平面深度之间的关系。
三、结果
在1951 USAF分辨率测试标板上测试了微型显微镜的分辨率后，研究人员在45度景深靶标上测量了焦深范围。由于双色微型显微镜的应用之一是通过在每帧交替光源和焦平面深度来同时记录两种光谱不同的指示剂，因此研究人员量化并比较了单通道和双通道成像的焦深能力。
首先，研究人员从绿色通道采集了100帧的测试数据，每次测试在不同的焦深下进行，覆盖了电润湿透镜所有可能的控制信号范围，共进行了24次测试。接着，基于每次测试平均帧的列平均像素值的拟合包络线中心，估算每次测试的焦平面深度，该中心代表45度景深靶标上聚焦的15线对/毫米垂直线的中心。
为证明在交替双色成像中实现了完整的焦平面切换，研究人员以类似方法估算了每个通道的焦平面深度，共进行了20次测试，并逐渐增大两个通道焦平面之间的差异。通过比较每个电润湿透镜控制信号对应的估算焦平面的线性拟合结果，观察到单通道绿色、双通道绿色和双通道红色的拟合斜率相似，表明在单通道和双通道交错模式下，对电润湿透镜控制信号的响应是相似的。
随后，研究人员使用一个直径为1毫米的Grintech梯度折射率透镜，在25毫米网格测试玻片上测试了微型显微镜，测量到了主要由梯度折射率透镜引入的合理水平的畸变。通过在Z轴方向以9.6微米为步长改变电润湿透镜的焦平面，研究人员在36个不同的轴向平面对靶标进行了成像。通过检测每条线交叉点的最佳焦平面，并通过线性回归估算出佩茨瓦尔曲率半径为343.1毫米。
图2.（A）一个标定用的25毫米网格靶标玻片图像，其上叠加了等间距的25毫米线交叉点，这些点与成像交叉点高度吻合。焦深0被定义为最多交叉点处于焦点平面的位置。（B）等间距25毫米线交叉点与实际显微镜视野中检测到的交叉点的叠加对比图。（C）系统畸变的测量结果。（D）佩茨瓦尔场曲率的测量：计算每个线交叉点的最佳焦平面，并通过线性回归估算拟合球面的半径和中心。（E）一个含有15微米直径荧光微珠的测试玻片在绿色通道和红色通道的样本图像：已识别出的微珠及其峰值亮度位置被高亮并编号显示。（F）图E所示测试玻片在针对7号微珠的最佳焦深下，绿色通道与红色通道的图像，展示了该代表性微珠在X-Y坐标位置上的X-Y、X-Z和Y-Z平面视图。图像的焦深在X-Z和Y-Z平面上用蓝色实线标出。（G）在绿色通道和红色通道检测到的每个15微米荧光微珠在X-Y平面以及三维空间中的峰值位置。（H）15微米荧光微珠在绿色通道与红色通道之间于X、Y、Z方向上的焦平面差异。（I）一个含有4微米直径荧光微珠的测试玻片在绿色通道的样本图像。（J）在绿色通道和红色通道检测到的每个4微米荧光微珠在X-Y平面以及三维空间中的峰值位置。（K）4微米荧光微珠在绿色通道与红色通道之间于X、Y、Z方向上的焦平面差异。
此外，研究人员还在直径为15微米和4微米的荧光微珠上测试了微型显微镜的性能。测量结果显示，横向色差有限，但轴向色差较为显著。为了校正轴向色差，可能需要通过控制电润湿透镜来调整焦平面。
随后，研究人员通过体内成像测试了微型显微镜在内侧前额叶皮层中的应用，该测试是在数月内每周一次的开阔场地实验中进行的。研究人员使用了两种光谱不同的指示剂来标记不同的神经元群体：在每次开阔场地实验开始前，仅打开565纳米LED，在5个不同的焦平面上记录100帧，以识别被tdTomato标记的神经元。
利用电润湿透镜能够持续稳定调整焦平面的能力，研究人员实现了对神经元长达5个月的追踪。在同一天的成像实验中，打开470纳米LED，进行了3.5分钟的开阔场地实验记录，捕捉了自由探索期间表达GCaMP的神经元的活动。这种方法使得研究人员能够根据两个通道的重叠情况识别特定的神经元亚群，并长期追踪不同神经元群体的活动。
图3.（A）在参考焦深D0（底座安装时设定）基础上，第35天和第112天，于5个不同焦深下记录的红色通道像素值（仅使用565纳米LED）的试验平均负像。每个焦深检测到的神经元图谱叠加显示（第35天为绿色，第112天为蓝色）。（B）第35天（绿色）与第112天（紫色）在中间焦深下记录的神经元图谱对比。
作为概念验证实验，研究人员首先使用tdTomato标记了Gad2-IRES-Cre小鼠的抑制性神经元，并同时通过GCaMP6f监测了内侧前额叶皮层中抑制性与兴奋性神经元的神经活动。研究人员还使用tdTomato标记了他莫昔芬诱导型CaMKII-IRES-Cre; TardbpF/F小鼠内侧前额叶皮层中的大多数兴奋性神经元，或采用逆行标记法用tdTomato特异性标记了第三层的兴奋性神经元。通过记录GCaMP6f的神经活动，研究人员比较了两种情况下红绿通道重叠神经元的比例。利用每个实验单元中两个视频流生成的神经元轮廓重叠情况，来匹配两个通道中识别出的神经元。结果符合预期：在CaMKII-IRES-Cre; TardbpF/F小鼠中，每个实验单元红绿通道神经元的重叠比例均高于逆行标记的第三层锥体神经元。
图4.（A）一只Gad2-IRES-Cre小鼠在同一天的红色通道记录的试验平均像素值，以及绿色通道记录的像素标准差。该小鼠的抑制性神经元被AAV-CAG-DIO-NLS-tdTomato标记，所有神经元则被AAV-hSyn-GCaMP6f标记。图中显示了各通道检测到的神经元轮廓，其中两个通道匹配的神经元用绿色高亮标出（深绿色代表GCaMP标记的神经元，浅绿色代表tdTomato标记的神经元）。（B）左图：红色通道与绿色通道识别出的神经元图谱叠加；右图：神经元图谱中单色高亮的代表性神经元的钙活动轨迹：蓝色轨迹属于仅在绿色通道检测到的神经元，绿色轨迹则属于在两个通道均检测到的神经元（深绿色代表GCaMP标记的神经元，浅绿色代表tdTomato标记的神经元）。
图5.（A）空间分布图显示了两只有代表性小鼠的红色通道平均帧及检测到的tdTomato神经元轮廓，绿色通道的帧峰值信噪比及检测到的GCaMP神经元轮廓，以及红绿通道神经元轮廓的叠加。仅在红色通道检测到的神经元轮廓显示为红色，仅在绿色通道检测到的神经元轮廓显示为蓝色，两个通道均匹配的神经元用实线轮廓表示。插图显示了各通道检测到的神经元数量及其重叠情况。（B）条形图展示了不同小鼠中两个通道匹配的神经元百分比。蓝色条形代表使用AAV1-CAG-DIO-NLS-tdTomato和AAV1-CaMKII-GCaMP6f标记大多数兴奋性神经元的CaMKII-IRES-Cre; TardbpF/F小鼠的数据；绿色条形代表使用AAVretro-hSyn-mCherry逆行标记第三层锥体神经元的数据。
四、讨论
在此，我们介绍了一款具备可变焦能力的双通道微型显微镜，可用于对不同神经元群体进行成像。该开源设计优势之一在于可使用成本相对较低的3D打印部件和通用组件构建。另一个优点是该设计具有高度可定制性，可根据具体需求和实验要求进行修改。例如，通过更换滤光片和光源，可将其功能拓展至不同的指示剂，或增加光遗传学功能，以实现对特定神经元群体活动的同步监测与调控。
我们通过在数月内对小鼠内侧前额叶皮层中两种遗传学特性不同的神经元群体进行开阔场地测试的体内成像，验证了该微型显微镜的功能。当仅依赖活跃神经元的空间分布时，跨越数周乃至数月的图像配准可能面临挑战，因为即使在相似行为下，活跃的神经元组合也可能随时间变化。为提升长期成像数据集的配准精度，并克服焦平面漂移和脑结构变化对长期神经元追踪的限制，双色微型显微镜可采用一种配置方案：一个通道专门测量神经元活动，另一个通道则静态标记神经元并生成稳定的神经元图谱，从而为被追踪神经元提供更精确的配准基础。
对于需要记录表达不同基因编码钙指示剂的两个神经元群体活动的研究，双色微型显微镜可通过在交替帧中切换光源和焦平面来实现。这得益于电润湿透镜的切换时间在毫秒量级，快于钙动力学的变化时间及钙成像的典型帧率。然而，在此模式下，每个通道的帧率会减半，导致采样频率降低，可能不足以研究发生在更快时间尺度上的神经过程或行为。反之，对于更高帧率成像及响应更快的指示剂，例如电压敏感染料成像，电润湿透镜的切换时间可能成为影响因素，需要在成像系统设计中予以审慎考虑。
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